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技术文章

原位杂交操作规程

原位杂交操作规程

（一）、仪器设备
     医用微波炉； 水浴锅。

     （二）、试剂
     0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容1L。100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L ris·Cl，0.15mol/L NaCl。BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。 

    （三）、操作流程
    1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天
    1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
    2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；
    3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；
    4） PBS清洗3分钟；
    5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
    6） PBS清洗10分钟；
    7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；
    8） PBS清洗2次，每次3分钟；
    9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
    10）PBS清洗2次，每次3分钟；
    11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
    12）PBS清洗2次，每次5分钟；
    13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
    14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；
    15）杂交；第二天
    16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；
    17）PBS清洗3分钟；
    18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；
    19）PBS清洗5分钟；
    20）室温，2×SSC清洗10分钟；
    21）37℃，1×SSC清洗10分钟；
    22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
    23）缓冲液A孵育10分钟；
    24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；
    25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim），37℃孵育3 小时；
    26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；
    27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
    28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；
    29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
    30）固红，脱水以及封片进行核的复染。
    2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天
    1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
    2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；
    3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；
    4） PBS清洗5分钟；
    5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
    6） PBS清洗5分钟；
    7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；
    8） PBS清洗2次，每次5分钟；
    9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
    10）PBS清洗2次，每次5分钟；
    11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
    12）PBS清洗5分钟；
    13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
    14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；
    15）杂交；第二天
    16）将玻片置于SSC中以去除封片；
    17）室温，2×SSC清洗10分钟；
    18）37℃，1×SSC清洗10分钟；
    19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
    20）缓冲液A孵育10分钟；
    21）缓冲液A孵育30分钟；
    22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；
    23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；
    24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
    25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；
    26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
    27）固红，脱水以及封片进行核的复染。 
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